Clorochina 241

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La clorochina riduce osteoclastogenesi nell'osteoporosi murino per prevenire il degrado TRAF3 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. 1 Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, e 2 Centro per la Ricerca muscoloscheletrico, Università di Rochester Medical Center, Rochester, New York, Stati Uniti d'America. Indirizzo corrispondenza: Brendan F. Boyce, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Box 626, Rochester, New York 14642, USA. Telefono: 585.275.5837 Fax: 585.273.3637 E-mail: BrendanBoyceURMC. Rochester. edu. Pubblicato la prima volta 9 dicembre 2013 - Maggiori informazioni pubblicate nel volume 124, Issue 1 (2 gennaio 2014) J Clin Invest. 2014124 (1): 297310. doi: 10,1172 / JCI66947. 2013 L'American Society for Clinical Investigation. Pubblicato la prima volta 9 dicembre 2013 ricevute: 19 Agosto, 2013 accettate: 3 ottobre 2013 Le citochine RANKL e TNF attivare la segnalazione NF-B in precursori degli osteoclasti (OCP) per indurre osteoclasti (OC) formazione. Viceversa, TNF può limitare la formazione OC attraverso p100 NF-B, che agisce come un inibitore, e TNF receptorassociated recettore 3 (TRAF3) Tuttavia, un ruolo per TRAF3 nella formazione OC RANKL-mediata è sconosciuta. Abbiamo scoperto che i limiti TRAF3 RANKL-indotta osteoclastogenesi sopprimendo canonica e non canonica di segnalazione NF-B. Condizionale specifiche OC TRAF3 - Ko (CKO) topi avevano osteoporosi mite e una maggiore formazione di OC. RANKL indotto degrado TRAF3 attraverso il sistema lisosomi / autofagia. L'inibitore clorochina autofagia / lisosomi ridotta formazione OC RANKL-indotta e la funzione, aumentando l'espressione TRAF3 in OCP in vitro e in vivo. Sebbene clorochina avuto alcun effetto sul riassorbimento osseo basale, è inibito l'ormone paratiroideo e attivazione OC ovariectomia indotta in WT, ma non CKO, topi. L'eliminazione del fattore di trascrizione del gene Relb portato ad un aumento dell'espressione TRAF3 in OCP, che è stata associata con diminuita degradazione TRAF3 RANKL-indotta. RelB aumentato direttamente espressione di becn1, un regolatore chiave di autofagia, legandosi al suo promotore. Questi dati indicano che il degrado autofagica / lisosomiale di TRAF3 è un passo importante per l'attivazione di NF-B RANKL-indotta in OCP. Inoltre, i trattamenti che aumentano i livelli di TRAF3 a OCP, tra cui l'inibizione farmacologica della sua degradazione con composti come la clorochina, possono limitare la distruzione ossea in malattie delle ossa comuni. omeostasi ossea è mantenuto da un delicato equilibrio tra riassorbimento osseo osteoclastico e formazione ossea osteoblastica. Turbativa di questo equilibrio, con un più alto tasso di riassorbimento osseo si verifica in disturbi del metabolismo e delle ossa infiammatorie, come l'osteoporosi post-menopausale e RA, con conseguente aumento del rischio di frattura e distruzione articolare, rispettivamente, (1). Gli osteoclasti (OC) riassorbono osseo in condizioni fisiologiche e patologiche (2), e la loro formazione e l'attività sono aumentati in osteoporosi e RA come risultato di un aumento della produzione di citochine proinfiammatorie, come TNF e RANKL, che attivano NF-B (3) . NF-B fattori di trascrizione regolano altre risposte cellulari immunitarie e numerosi e giocano un ruolo critico nello sviluppo scheletrico, encondrale, funzioni OC e osteoblasti, e le malattie delle ossa comune (4). Nei mammiferi, ci sono 5 NF-B membri della famiglia: RELA (p65), RelB, e c-Rel, e le proteine ​​precursori NF-B1 (p105) e NF-B2 (P100), che vengono trasformati in p50 e p52, rispettivamente (5). segnali NF-B canoniche attraverso IKK e NF-B modulatore essenziale (NEMO), che porta alla fosforilazione di IB e traslocazione di p65 / eterodimeri p50 in nuclei in risposta a citochine noncanonical NF-B stimola la fosforilazione IKK-mediata di p100 attraverso l'attivazione di NF chinasi - Binducing (NIK) e conduce al trattamento dei p100 di p52 e il rilascio di RelB complessi / p52. segnalazione non canonici è indotta da membri della famiglia del TNF, tra cui RANKL, ligando CD40, BAFF, e lymphotoxin - (5). Un ruolo per la segnalazione NF-B in osso è stato identificato nel segnalazioni di guasto osteoclastogenesi citochine indotta a NF-B1 / 2 topi doppio KO (6. 7), ma NF-Binduced osteoclastogenesi di citochine rimane incompleto capito. NF-B è un regolatore fondamentale di RANKL - e differenziazione TNF-indotta osteoclasti precursore (OCP) e si attiva tramite il TNF receptorassociated fattori (TRAFs), che condividono un dominio TRAF comune C-terminale strutturale che media oligomerizzazione e legame al recettore. RANKL attiva sia canonica e non canonica di segnalazione NF-B in OCP attraverso TRAF6 e Nik, che porta alla attivazione di IKK e IKK, rispettivamente (4 8), e alla segnalazione stimolante ed inibitorio nelle cellule (5). Analogamente, TNF stimola la formazione OC direttamente, ma limita anche RANKL e formazione OC TNF-mediata, aumentando i livelli cellulari di NF-B p100 (9) e altre proteine ​​inibitorie (4. 10). TNF induce tipicamente meno OC di RANKL in vitro quando si utilizzano WT OCP, ma induce un numero simile di CO da NFKB2 / OCP come RANKL e anche robusta formazione OC in Rankl / e Rank / topi carenti di p100. Questi risultati indicano che p100 inibisce il TNF-indotta osteoclastogenesi da un TNF receptorassociated recettore 3dependent (TRAF3-dipendente) Meccanismo (9), ma il meccanismo per cui TRAF3 inibisce osteoclastogenesi è stato poco chiaro, anche se richiede NIK degrado (11). Oltre al loro ruolo di proteine ​​adattatrici, TRAFs agiscono anche come E3 ligasi ubiquitina, una funzione cruciale per l'attivazione della segnalazione NF-B (12). Sovraespressione e studi genetici identificati ruoli di attivazione positivi per TRAF2, -5 e -6 in canonica di segnalazione NF-B (13 15). Tuttavia, lo studio del ruolo dei TRAF3 nella segnalazione NF-B è stato difficile perché la maggior parte topi TRAF3 - Ko muoiono entro la prima settimana dopo la nascita (16). Un rapporto che TRAF3 è costitutivamente destinato a NIK e media NIK ubiquitinazione e la degradazione nelle cellule B identificato un ruolo regolatore negativo critico TRAF3 nella segnalazione non canonica (17). accumulo Inoltre, TRAF3 / topi hanno segnato B cellule di NIK, e la carenza composto di NF-B P100 in salvo la loro mortalità post-natale precoce (18). Nonostante la carenza di NIK o la sua molecola di segnalazione a valle, RelB, sembra avere poco effetto sulla omeostasi ossea basale, Nik / e RelB / topi hanno osteoclastogenesi difettoso in risposta a un'osteolisi patologica in vivo (8. 19). Inoltre, i topi transgenici con sovraespressione OC-mirata di un mutante NIK privo del dominio TRAF3 vincolante sono diminuite massa ossea e aumento erosione ossea in un modello siero trasferimento di RA (11). Collettivamente, questi dati indicano che NIK e TRAF3 giocano importanti ruoli normativi negativi in ​​noncanonical segnalazione NF-B. I topi con delezione specifica-OC di TRAF3 sono aumentati osteoclastogenesis e l'osteoporosi, mediato da un aumento della segnalazione canonica e non canonica NF-B. Coltura di cellule WT BM con M-CSF per 2 giorni, seguiti da RANKL in genere si traduce in microscopiche CO riconoscibili 4 giorni più tardi (dati non riportati). Espressione del NFATc1, il regolatore maestro di osteoclastogenesi (4), è aumentato in modo significativo 4 giorni dopo il trattamento RANKL, mentre i livelli di proteina TRAF3 diminuito progressivamente (Figura 1 A) e livelli TRAF3 mRNA è rimasto invariato (Supplemental Figura 1A materiale supplementare disponibile online con questo articolo doi : 10,1172 / JCI66947DS1). Abbiamo generato un TRAF3 espressione vettore retrovirale con l'inserimento di un frammento TRAF3 cDNA umano in un PMX-IRES-GFP espressione vettore retrovirale. Dopo transfecting vettori PMX-TRAF3-IRES-GFP PMX-IRES-GFP o in cellule di packaging piastra con Fugene 6, surnatanti virus sono stati raccolti e aggiunti al WT OCP generato dalla coltura di cellule BM con M-CSF per 3 giorni (20). Circa 6070 l'efficienza infezione è stata confermata in tutti i campioni di citometria di flusso (dati non riportati). cellule GFP sono state ordinate e coltivate con M-CSF più RANKL. Numerosi acida tartrato-resistente (TRAP) phosphatasepositive OC sono state osservate nelle cellule PMX-GFPinfected, ma la formazione di OC è ridotto di circa 3 volte in celle PMX-TRAF3-IRES-GFPinfected (Figura 1 B). I topi con delezione specifica-OC di TRAF3 sono aumentati osteoclastogenesi e l'osteoporosi lieve mediata da un aumento della segnalazione canonica e non canonica NF-B. (A) WBS di TRAF3 e di espressione NFATc1 nelle cellule WT BM trattate con M-CSF più RANKL. Lanes sono stati eseguiti sullo stesso gel, ma erano non contigue. (B) OC formate da OCP WT FACSAria-ordinati infettate con GFP o TRAF3-IRES-GFP (TRAF3-GFP) retrovirus trattati con RANKL. ingrandimento originale, 10. centri di OC. OC TRAP sono stati contati. cellule (C) BM-C-derivato CKO o WT coltivate con RANKL. P 0.05. (F) WBS di lisati cellulari interi di WT OCP infettati con GFP o TRAF3-IRES-GFP retrovirus e coltivate con RANKL per 5 giorni. (G e H) WBS di WT e L-CKO OCP trattati con RANKL per 48 ore. Cito, citoplasmatica. Abbiamo poi generato 2 nuove linee di topi con espressione TRAF3 mirati alle cellule lignaggio OC: TRAF3 f / f catepsina K CRE (che noi chiamiamo C-CKO) e TRAF3 f / f lisozima M cre (L-CKO) i topi, e ha scoperto che cellule C-CKO BM coltivate con M-CSF più RANKL per 3 giorni formate TRAP multinucleati OC, ma culture WT no (Supplemental Figura 1B). Anche se le cellule WT C-CKO e avevano formato un numero simile di CO 2 giorni più tardi, CO C-CKO erano più grandi, con conseguente significativo aumento dell'area OC (Supplemental Figura 1B) e suggerendo che TRAF3 regola negativamente osteoclastogenesi e forse la fusione. Abbiamo osservato risultati simili nelle cellule di topi L-CKO (dati non riportati). topo L-CKO e C-CKO hanno normali fenotipi ossa, simili a topi WT (Supplemental Figura 1C). Così, abbiamo usato fratellini Cre come controlli WT per esperimenti futuri. Quando abbiamo usato RANKL a basse concentrazioni (5 g / ml), WT OC generalmente formata dopo e erano più piccoli (dati non mostrati), ma le cellule C-CKO in queste condizioni ha una maggiore capacità OC-formatura di cellule WT (Figura 1 C) e l'aumento dei settori pit riassorbimento quando coltivate su fette di osso con M-CSF più RANKL per 9 giorni, anche se i numeri OC erano simili da questo momento (Supplemental Figura 2). Abbiamo anche coltivate queste cellule in piastre da 6 pozzetti per 6 giorni, risospese le cellule con tripsina 0,25 / EDTA e ripiastrate numero uguale di CO su fette di osso in piastre a 96 pozzetti per altri 4 giorni. Riassorbimento zona box e numeri erano simili tra C-CKO e WT OC (dati non riportati), in linea con TRAF3 avente ruolo importante nella formazione OC RANKL-indotta, piuttosto che la funzione. È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che i topi 2 mesi C-CKO hanno l'osteoporosi lieve, come indicato dalla significativamente ridotto tibiale volume osseo trabecolare (BV) (Figura 1 D), il numero trabecolare, e spessore, con valori medi per la connettività trabecolare e la separazione essendo numericamente inferiori e superiori, rispettivamente, ma questi non ha raggiunto la significatività statistica (Supplemental Figura 1D). Questi sono stati associati ad un aumento del numero OC e superfici (Figura 1 E), rispetto ai topi di controllo. Precedenti studi TRAF3 iperespressione a cellule B hanno suggerito che TRAF3 sopprime l'attivazione di NF-B canonica (21). Per testare il meccanismo attraverso il quale TRAF3 inibisce osteoclastogenesis, abbiamo esaminato i livelli della proteina canonici e non canonici in OCP sovraesprimono TRAF3 in risposta a RANKL e osservato notevolmente aumentata espressione di NFATc1, NIK, p52, RelB, e RelA in PMX-GFPinfected OCP (Figura 1 F ). In RANKL trattati con PMX-TRAF3-IRES-GFPinfected OCP, induzione di NFATc1, NIK, RELA, e RelB è stato ridotto rispetto ai controlli GFP-infetti, accompagnati da una diminuzione P100 al trattamento P52 (Figura 1 F). Coerentemente con questi risultati, abbiamo osservato un aumento livelli RELA, RelB, e Nik e una maggiore P100 al trattamento p52 in L-CKO OCP, anche in assenza di stimolazione RANKL (Figura 1 G). Ulteriore aggiunta di RANKL non ha influenzato i livelli di espressione di queste molecole, presumibilmente riflettendo precedente esposizione di pile a RANKL in vivo o gli effetti di NIK costitutivamente attiva. Inoltre, RELA traslocazione nucleare è aumentata a L-CKO OCP in basali e condizioni RANKL-indotta (Figura 1 H), indicando una maggiore segnalazione NF-B. Abbiamo osservato risultati simili a cellule C-CKO (dati non riportati). TRAF3 dominio anulare è richiesto per la degradazione TRAF3 RANKL-indotta attraverso un / meccanismo di autofagosoma-dipendente lisosomi. TRAF3 contiene 3 principali domini: un anulare (RF), necessaria per la soppressione di NIK (22) un dito di zinco (ZF), per l'attivazione di NF-B (23) e un dominio TRAF, che lega proteine ​​degradazione targeting, quali come NIK (22). Noi sovraespresso RANK e TRAF3 in cellule 293T per esaminare quale dominio TRAF3 o domini sono necessari per la sua degradazione. i livelli di proteina TRAF3 diminuiti significativamente in queste cellule con deprivazione di siero, che possono indurre l'autofagia in molti tipi di cellule (24), e con il trattamento RANKL (Figura 2 A). Al contrario, TRAF3 cumulabile con la fame siero o RANKL nelle cellule che esprimono TRAF3 mutanti di delezione che mancano sia la RF o RF e domini ZF. Al contrario, con siero-fame o trattamento RANKL, livelli TRAF3 leggermente diminuite in cellule con il dominio TRAF cancellato. Abbiamo osservato risultati simili a L-CKO OCP con infezione da retrovirus TRAF3 WT e mutanti. Questi risultati contrastano con un rapporto che un mutante NIK manca il dominio TRAF3 vincolante è costitutivamente attivo (11). Essi suggeriscono che il dominio TRAF3 vincolante NIK è necessario per la degradazione del proteasoma NIK, mentre il dominio TRAF di TRAF3 non è essenziale per la degradazione TRAF3. degrado TRAF3 RANKL-indotta è lisosomi mediato. cellule (A) 293T trasfettate con HA-tagged WT o costrutti TRAF3 mutanti. L-CKO OCP BM-derivati ​​infettati da virus PMX-TRAF3 WT o mutanti sono stati siero privati ​​o trattati con RANKL per 8 ore. (B) ubiquitinato (Ub) proteine ​​da lisati cellulari intere di RANKL-trattati (2 ore) WT OCP utilizzando UbiQapture-Q Matrix cancellati con l'anti-TRAF3 Ab. (C) WT OCP pretrattati con NH 4 Cl (50 mM) per 1 ora, CQ (50 mM) per 6 ore, o MG132 (20 mM) per 4 ore sono stati trattati con RANKL per 8 ore. Per IB, WT OCP sono stati trattati con DMSO o MG132 con o senza RANKL per i tempi indicati. Lanes sono stati eseguiti sullo stesso gel, ma erano non contigue in B e C. (D) WT OCP pretrattato con bafilomicina (Bafilo 50 ng / ml) per 16 ore o 3-MA (3-MA (5 mM) per 2 ore sono stati trattati con o senza RANKL per 8 ore in condizioni di siero arricchito o - deprived . (e) TRAF3-GFP retrovirusinfected WT OCP trattati con RANKL per 8 ore sono state fissate e doppio-colorate con TRAF3 e LAMP2 Abs. trama di sinistra mostra la colorazione di fondo con Abs controllo isotipico. (F) TRAF3-GFP retrovirusinfected OCP WT colorati con anti - LAMP2 Ab. Colocalizzazione valutata utilizzando la microscopia confocale. ingrandimento originale, 60. (G) TRAF3-GFP retrovirusinfected WT OCP trattati con o senza RANKL o CQ (2 mm) sono state colorate con anti-LAMP2 Ab. TRAF3 / LAMP2 cellule doppio positive sono stati contati. ingrandimento originale, 20. P 0.05. CD40 o BAFF-R impegno in cellule B induce un rapido, proteasoma-dipendente degradazione TRAF3 (25). Per determinare se RANKL induce TRAF3 ubiquitinazione e la degradazione di OCP, abbiamo incubato le proteine ​​endogene TRAF3 con una matrice di affinità ubiquitina-alto legame e le proteine ​​ubiquitinate catturate utilizzando un anti-TRAF3 Ab. RANKL notevolmente aumentato TRAF3 ubiquitination (Figura 2 B), che può verificarsi in proteasomi, lisosomi, e autophagosomes in cellule di mammifero (26). Per esaminare il meccanismo coinvolto, abbiamo pretrattati WT OCP con il lisosoma inibitori clorochina (CQ) per 6 ore o NH 4 Cl per 1 ora o con il MG132 inibitore del proteasoma per 4 ore, seguita da RANKL, e valutato l'entità del degrado TRAF3 da Western blot (WB). Il pretrattamento con uno CQ o NH 4 Cl, ma non MG132, marcatamente aumentato livelli TRAF3 in risposta a RANKL (Figura 2 C). Per confermare che MG132 ha funzionato efficacemente come un inibitore del proteasoma (27), abbiamo trattato WT OCP con RANKL più MG132 per 15 e 30 minuti e abbiamo trovato che rispetto al controllo DMSO, MG132 bloccato RANKL-indotta IB degradazione (Figura 2 C). Abbiamo poi testato inibitori autofagia sulla degradazione TRAF3 RANKL-indotta. Bafilomicina A1 blocca la fusione del autofagosoma e lisosomi (28) ha aumentato accumulo di TRAF3 (Figura 2 D). 3-metiladenina (3-MA), che blocca PI3K, non ha avuto effetto sulla degradazione TRAF3 in condizioni di siero arricchito. Tuttavia, TRAF3 accumulato in OCP siero-privato trattati con 3-MA (Figura 2 D), coerente con 3 MAinhibiting autofagia solo in cellule siero-privato (29). Abbiamo poi infettati WT OCP con un retrovirus PMX-TRAF3-GFP e abbiamo trovato che TRAF3 e LAMP2 (un marcatore lisosoma) sono stati coexpressed in circa 23 cellule di RANKL-trattati (Figura 2 E). La microscopia confocale ha dimostrato che la proteina di fusione TRAF3-GFP è stato localizzato principalmente nel citoplasma in OCP (Figura 2 F). RANKL aumentato significativamente colocalization di TRAF3 e LAMPADA2, che è stato ridotto di CQ (Figura 2 G). CQ inibisce RANKL-indotta la formazione di OC, impedendo la degradazione lisosomiale di TRAF3. Per determinare se CQ influisce sulla formazione OC, abbiamo coltivato le cellule WT BM con M-CSF per 2 giorni, RANKL aggiunto, e colorate per l'attività TRAP nei giorni 2, 4, 5, e 6. Due giorni dopo l'aggiunta RANKL, OCP differenziato in cellule mononucleate TRAP, che abbiamo chiamato pre-OC, che alla fine fuse per formare OC oltre i seguenti 2 giorni (Figura 3). Quando abbiamo aggiunto CQ durante le fasi iniziali della formazione OC, il numero totale di OC e grandi OC e zona OC erano significativamente ridotta la dose dipendente, con la dose più alta (10 M) induce una riduzione di 3 volte del numero OC (Figura 3 B ). L'aggiunta di CQ durante le fasi successive di formazione OC ridotta zona OC, senza effetti sui numeri OC totali e grandi (Figura 3 C). Inoltre, quando queste OCP sono stati trattati con RANKL più CQ per 3 giorni, la percentuale di cellule apoptotiche e morte era simile a quella dei controlli (6.1 vs. 5.3, dati non mostrati). Così, CQ inibisce la differenziazione OCP, ma non la fusione OCP o la sopravvivenza OC. CQ inibisce la formazione OC in vitro. (A) tipica in vitro formazione OC tempo portate. BM-derivati ​​WT OCP sono stati trattati con M-CSF (M) per 2 giorni e con M-CSF più RANKL (R) per 4 giorni. CQ è stato aggiunto il giorno 2 (B), o il giorno 4 (C). ingrandimento originale, 4. P 0,01 vs. PBS. CQ è un agente antimalarico, e come il suo derivato, idrossiclorochina, è stato utilizzato nelle prime fasi del trattamento del lupus eritematoso sistemico e RA, ma l'esatto meccanismo di azione nelle malattie autoimmuni non è chiaro (30). Abbiamo scoperto che i livelli di TRAF3 sono aumentati notevolmente negli OCP dopo il trattamento CQ (10 M per 3 giorni) questo è stato accompagnato da una diminuzione dell'espressione NFATc1 (Figura 3 D). Abbiamo infettati OCP da TRAF3 f / f topi con MSCV-Cre-GFP (dove MSCV indica virus cellule staminali murine) o MSCV-GFP retrovirus e ordinati cellule GFP per verificare la cancellazione di TRAF3 (figura 3 E). cellule GFP Ordinati poi sono state coltivate con o senza CQ in saggi di formazione OC. TRAF3-carente e WT OCP formato un numero simile di CO, e CQ ridotto numero OC da cellule WT (80), ma non ha avuto effetto sulle cellule TRAF3-deficienti (Figura 3 F). Abbiamo poi confermato specifico delezione di proteine ​​TRAF3 nelle cellule BM e OCP da topi L-CKO (Figura 3 G) e abbiamo trovato che CQ non ha inibito la formazione di OC RANKL-indotta nelle cellule TRAF3-deficienti (Figura 3 H). CQ inibisce la formazione OC in vitro e PTH - e riassorbimento osseo ovariectomia indotta in vivo via TRAF3. Abbiamo poi coltivate OCP WT su fette di osso con RANKL per 9 giorni e ha scoperto che le cellule CQ-trattati formano pochi OC Trap (12 vs 3 656 17 controlli) e pochi pozzi di riassorbimento, che coprivano molto poco delle fette di osso (0,04 0,01 mm 2) rispetto ai controlli dove fosse occupato la maggior parte della superficie (6,9 0,7 millimetri 2) (Figura 4). Abbiamo poi trattati a 3 settimana - o 3 mesi di età topi WT e C-CKO con CQ (25 mg / kg ip, una volta al giorno) per 28 giorni e abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel BV o altri parametri strutturali valutati da CT in tibie confrontati con quelli dei topi trattati con veicolo (riferimento figura 3, A e B), suggerendo che questo regime di CQ non ha effetto sul riassorbimento osseo basali o massa ossea. saranno necessari ulteriori studi tempo-corso e dose-risposta per determinare se CQ in grado di inibire il riassorbimento osseo basale. CQ influisce sulla funzione OC in vitro e in vivo. (A) WT OCP in coltura con RANKL con o senza CQ (5 M) per 9 giorni. TRAP colorazione (pannelli di sinistra) e blu toluidina (pannelli di destra, per evidenziare pozzi riassorbimento). I valori sono mezzi SEM di 4 pozzi. P 500 m (C e D). Per determinare se CQ influisce sulla formazione degli osteoblasti o una funzione, abbiamo effettuato CFU-F, CFUalkaline fosfatasi (CFU-ALP), e saggi di formazione di noduli osseo utilizzando 2 M CQ, che inibisce la formazione di OC. Abbiamo trovato che CQ non ha avuto effetti su uno qualsiasi di questi indici di funzione degli osteoblasti in cellule stromali WT BM (Supplemental figura 4A), suggerendo che l'effetto predominante del CQ è in OC. L'ormone paratiroideo (PTH) è un regolatore primario dell'omeostasi del calcio e ha sia effetti anabolici e catabolici, associati alla somministrazione intermittente o continuo, rispettivamente, (31. 32). Per verificare se CQ colpisce formazione dell'osso PTH-indotta, abbiamo somministrato PTH (2 g / kg, 3 / d) intermittenza per topi WT per 14 giorni insieme CQ (50 mg / kg, 1 / d). trattamento PTH significativamente aumentato trabecolare BV, spessore trabecolare, e apposizione minerale (MAR) e la velocità di formazione ossea (BFR), ma CQ avuto alcun effetto (Supplemental figura 4, BD). Abbiamo poi esaminato gli effetti di CQ in un modello in vivo di riassorbimento osseo patologico in cui PTH stimola la formazione OC inducendo l'espressione RANKL (33). Abbiamo trattato L-CKO o topi di controllo Cre-negative con CQ (50 mg / kg, 1 / d), per 7 giorni, seguiti da CQ più PTH (10 g / mouse, 4 / d, sc sopra Calvariae) per altri 3 giorni ( 34). CQ marcatamente ridotta formazione OC PTH indotta Calvariae e tibie in topi WT rispetto al trattamento PBS, ma non in L-CKO topi (figura 4. B e C, e Supplemento Figura 5, A e B). Un modello simile di cambiamento è stato osservato nei livelli sierici TRAP5b (Supplemental Figura 5D). Inoltre, la fibrosi del midollo (un marchio di garanzia del riassorbimento PTH-indotto) è stato osservato in tutti i gruppi, tranne i topi WT trattati con CQ e PTH (figura 4 D e supplementare Figura 5C). Risultati simili sono stati ottenuti in un esperimento separato che utilizza topi C-CKO (dati non mostrati). Per valutare ulteriormente gli effetti di CQ sul riassorbimento osseo in vivo, abbiamo utilizzato da 8 a 9 settimane di età femminile C-CKO o topi di controllo Cre-negativi in ​​un modello ovariectomia (OVX). Due giorni dopo la chirurgia, i topi sono stati trattati con PBS o CQ (50 mg / kg, per via intraperitoneale 1 / d) per 28 giorni, e tibie sono stati analizzati utilizzando CT e istologia. Quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, il peso dell'utero e la BvS tibiale nei topi OVX sono stati notevolmente ridotti rispetto a quelli di topi WT e C-CKO sham, coerente con OVX, e la BvS erano significativamente più bassi in C-CKO rispetto ai topi WT (Figura 5 A e supplementare Figura 6A). Inoltre, CQ impedito perdita OVX indotta ossa e numeri aumentati OC e superfici in topi WT, ma non in C-CKO topi (figura 5. A e B, e Supplemento figura 6, B e C). CQ previene la perdita ossea OVX indotta in WT, ma non nei topi C-CKO. OVX o 8 a 9 settimane di età topi WT e C-CKO sham trattati con PBS o CQ (50 mg / kg / die per via intraperitoneale per 28 giorni). immagini (A) Rappresentante CT della tibia e la BvS trabecolare. (B) Rappresentante sezioni tibiali TRAP macchiati e dati istomorfometrici per superficie OC e numeri. I valori sono la media SEM di 59 topi / gruppo. P 0.05. aree in scatola sono mostrati a più alto ingrandimento supplementare Figura 6B. bar Scala: 500 m. RelB è richiesto per la degradazione lisosomiale TRAF3 RANKL-indotta da regolare l'espressione becn1. Abbiamo poi studiato i livelli basali TRAF3 e inducibile in RelB / OCP, in parte perché la segnalazione RANKL / NIK / p100 attiva RelB (5) e anche per determinare se RelB regola la degradazione TRAF3. Basali livelli di proteine ​​TRAF3 erano 5 volte maggiore nelle cellule RelB / BM rispetto alle cellule WT (Figura 6 A). Inoltre, a differenza della riduzione tempo-dipendente dei livelli TRAF3 indotte da RANKL WT OCP (Figura 1 A), significativo accumulo di proteine ​​TRAF3 stata osservata in RelB / OCP RANKL trattate (Figura 6 B), suggerendo che RelB promuove RANKL-indotta degradazione TRAF3. Per verificare ciò, abbiamo infettati RelB / OCP con PMY-RelB per determinare se l'aggiunta di nuovo RelB potrebbe ripristinare il degrado TRAF3 RANKL-indotta. livelli TRAF3 diminuito in modo significativo nel controllo GFP virusinfected OCP 8 ore dopo la stimolazione RANKL (simile alla figura 2 C). Questa diminuzione non si è verificato nel controllo GFP virusinfected RelB / OCP, ma è stato visto in RelB / OCP iperespressione PMY-RelB (Figura 6 C). RelB regola positivamente degrado TRAF3 RANKL-indotta. (A) WBS di WT e RelB / BM lisati cellulari intero e livelli TRAF3 quantificati densitometricamente (media SEM di 3 macchie). (B) WBS di RelB / OCP RANKL-trattati. (C) WBS di WT o RelB / OCP infettati con PMY-GFP o PMY-RelB-GFP retrovirus per 2 giorni e trattati con RANKL per 8 ore. Arrowhead, banda specifica RelB. Lanes sono stati eseguiti sullo stesso gel, ma erano non contigue. (D) WT o RelB / OCP infettate con lentivirus controllo GFP shRNA (Ctl-shRNA) o TRAF3 shRNA per 2 giorni sono state coltivate con MCSF più RANKL per 4 giorni. TRAF3 atterramento è stato confermato mediante RT-PCR. numero totale di CO e grandi OC sono stati contati. immagini (E) EM di WT o RelB / OCP trattati con RANKL per 4 giorni in camera di coltura 2 pozzetti mostrando autophagosomes (frecce). M-CSF più cellule RANKLtreated RelB / BM generato un numero significativamente inferiore OC maturi rispetto alle cellule WT (8). Per studiare ulteriormente il ruolo di TRAF3 in queste condizioni, noi infettati WT e RelB / OCP con GFP controllo (Ctl-GFP) o TRAF3 shRNA lentivirus e confermato TRAF3 atterramento mediante RT-PCR. i livelli di mRNA TRAF3 erano 35 più elevato in RelB / che in OCP di controllo (Figura 6 D), e RelB / cellule formano un minor numero di contraccettivi orali rispetto alle cellule WT. TRAF3 atterramento indotto un numero significativamente maggiore OC da RelB / cellule (267 da 18 a 490 54), e in misura maggiore rispetto alle cellule infettate da virus WT (367 6 Figura 6 D). Per esplorare ulteriormente il ruolo della RelB nella degradazione lisosomiale TRAF3 RANKL-indotta, abbiamo usato EM trasmissione (ampiamente utilizzato per monitorare autofagia) (35) per valutare la capacità di WT e RelB / cellule a formare autofagosomi. Primi passi in autofagia includono la formazione e l'espansione di una membrana di isolamento, chiamato anche un phagophore, i cui bordi si fondono per formare un autofagosoma, una vescicola doppio con membrana che sequestra materiale citoplasmatica. Autophagosomes quindi fondono con i lisosomi per formare autolysosomes dove il materiale acquisito, insieme alla membrana interna è degradata (36). vacuoli autofagici con i caratteristici doppi membrane formate in WT, ma non in RelB /. cellule in risposta a RANKL (Figura 6 E). Dopo aver dimostrato che il degrado TRAF3 RANKL-indotta è lisosomi / autofagia mediata, abbiamo poi esaminato i livelli di proteina in OCP di ATG5, ATG7, ATG8, e Beclin 1 (becn1), molecole chiave nella formazione dell'autofagosoma (37). RANKL upregulated espressione di becn1 (3 volte), ma non delle altre proteine ​​autofagici (Figura 7 A). Inoltre, RANKL indotta degradazione TRAF3 e autolysosome formazione erano insufficiente in cellule con shRNA knockdown di becn1, ma non di ATG5 / 7 (Figura 7. B, C ed E), associato ad una significativa riduzione del numero di OC (Figura 7 D ). livelli TRAF3 in OCP trattati con ATG5 / 7 shRNA è sceso in risposta a RANKL, simile a controllare shRNA, ma questo è stato associato ad una ridotta osteoclastogenesi e l'aumento autolysosome numeri, suggerendo che ATG5 / 7 possono regolare il degrado di altri modulatori che contribuiscono alla RANKL - formazione OC indotta. degradazione TRAF3 RANKL-indotta è assente in becn1, ma non in ATG5 / 7 knockdown OCP. (A) WBS di WT OCP trattati con RANKL. (B) E WT OCP infettate con Ctl-GFP, becn1, o ATG5 e ATG7 shRNA lentivirus per 2 giorni. (B) i livelli di mRNA di becn1, ATG5, e ATG7. (C) WB delle cellule infette trattate con RANKL per 8 ore. (D) OC formate da cellule infette in coltura con RANKL per 5 giorni. P 0,05 vs. Ctl-GFP shRNA. J Bone Miner Res. J Clin Invest. PLoS One. Nat Rev Immunol. Nat Rev Immunol. Scienza. Natura. Scienza. Cella. J Physiol cellulare. J Bone Miner Res. J Clin Invest. Cella. Cella. Scienza. Cella. Natura. J Clin Invest. J Bone Miner Res. Lancetta. J Bone Miner Res. Natura. Natura.